El primer paso de la reacción febril es la detección del patógeno invasor, que pueden ser una gran variedad de agentes como bacterias, virus, vacunas, moléculas orgánicas, polvo y toxinas. Una vez que se produce el ingreso de patógenos al organismo, se produce la activación de las células del sistema inmune, tales como linfocitos T, monocitos y macrófagos que liberan diversas moléculas de señalización conocidas como las citoquinas pirogénicas.
El aumento de citoquinas producidas por monocitos en relación con la contaminación pirogénica fue descripto por primera vez en 1948 por Beeson, quien identificó los llamados 'leucocitos-pirógenos' como mediadores de la fiebre (1). Una citoquina pirogénica importante y bien investigada es la interleuquina -1β (IL-1β); también se han identificado otras citoquinas pirogénicas, como el factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleuquina -6 (IL-6). Las tres citoquinas pirogénicas juegan un papel clave en la patogénesis de la fiebre. Esto se debe a que actúan como mensajeros celulares, viajan por el torrente sanguíneo hasta alcanzar el hipotálamo, donde promueven la producción de prostaglandinas que se unen a neuronas específicas provocando un aumento en la producción y liberación de norepinefrina. Finalmente, la norepinefrina aumenta la termogénesis al quemar el tejido adiposo y promueve la vasoconstricción, elevando así la temperatura corporal. Es por eso que la cuantificación de la producción de citoquinas mediadas por monocitos es un paso crucial en la detección de patógenos pirogénicos en una muestra de prueba.
Las pruebas de pirógenos son un requisito para la comercialización de soluciones parenterales y dispositivos médicos.
Antes de que la mayoría de los medicamentos y dispositivos médicos que se inyectan o implantan en nuestro cuerpo puedan comercializarse, los fabricantes deben demostrar ante las agencias reguladoras que están libres de sustancias o patógenos que activen nuestro sistema inmunológico y puedan causar fiebre o síntomas más graves, como shock séptico y muerte.
Prueba de pirógenos con uso de animales de experimentación
Las pruebas tradicionales para detectar pirógenos usan animales. La prueba de pirógenos en conejos (RPT, por sus siglas en inglés rabbit pyrogen test) que ha estado en uso desde la década de 1940. Se inmoviliza a los conejos y se les inyecta una sustancia de prueba mientras se controla su temperatura corporal en busca de cambios que sugieran que la sustancia podría estar contaminada con pirógenos. En esta prueba, los conejos pueden sufrir reacciones dolorosas, problemas respiratorios, insuficiencia circulatoria y orgánica, e incluso un shock fatal. La segunda prueba que usa animales es la prueba de endotoxinas bacterianas (BET, por sus siglas en inglés bacterial endotoxins test), se desarrolló en la década de 1960 y utiliza la hemolinfa de cangrejos de herradura la cual se obtiene por un proceso de extracción manteniendo a los animales vivos.
Ventajas de la prueba por activación de monocitos (MAT)
A pesar de su larga historia de uso, las pruebas de pirógenos en conejo y cangrejo herradura nunca se validaron formalmente. Estas pruebas tienen una serie de deficiencias bien documentadas, como son los diferentes mecanismos en que los conejos, los cangrejos herradura y los humanos responden a los contaminantes o patógenos, lo que cuestiona la validez de los modelos.
La forma más precisa de medir la reacción pirógena en humanos es mediante una prueba que imita la respuesta humana a los pirógenos: la prueba de activación de monocitos (MAT, por sus siglas en inglés monocyte activation test), que utiliza células de sangre humana donada y está disponible desde la década de 1990. Esta prueba detecta pirógenos al medir la respuesta inmunitaria de los monocitos cuando se exponen a una sustancia de prueba, en un proceso que permite la cuantificación directa de la producción de citoquinas mediada por los monocitos activados. En consecuencia, MAT puede detectar la presencia de pirógenos en la muestra de prueba.
MAT fue adoptada por la Comisión de la Farmacopea Europea en marzo de 2009 y entró en vigor en septiembre del mismo año. Nació como reemplazo de las pruebas de pirógenos en animales, destacándose principalmente por no registrar diferencias en los mecanismos que generan el proceso febril en humanos, lo que no sucedía usando conejos y cangrejos herradura. Además, se necesita un volumen de muestra de prueba más bajo (importante para medicamentos costosos como las preparaciones de factor VIII o inmunoglobulinas). Otra ventaja es que MAT se puede usar para quimioterapéuticos y otros productos que no se pueden probar en conejos. Y por último, vale destacar que MAT es aproximadamente 10 veces más sensible que las pruebas en animales.
Los reguladores en Europa han agregado MAT a la lista de pruebas que están disponibles para detectar la contaminación por pirógenos y están alentando a las empresas a usarla reemplazando las pruebas en animales.
En los EE. UU., los miembros de PETA (People for the Ethical Treatment of Animals) están instando a la FDA a reconsiderar su requisito de que las empresas utilicen las pruebas del conejo y el cangrejo herradura y están trabajando con el organismo regulador y con las empresas para acelerar la adopción de pruebas sin animales.
Bibliografía:
-(1) BEESON PB. Temperature-elevatingeffectof a substance obtained frompolymorphonuclear leucocytes. J Clin Invest. 1948 Jul;27(4):524. PMID: 18939147.