El LMA está incorporando métodos alternativos que permitan estimar el riesgo sensibilizante de fitosanitarios, cosméticos, dispositivos médicos y productos de higiene del hogar. En este número presentamos una estrategia desarrollada por diversos laboratorios y avalada por organismos regulatorios, que consiste en integrar la evaluación de distintos eventos clave del proceso de sensibilización dérmica para predecir el riesgo de que la misma se presente como consecuencia de la exposición a distintos productos.
El LMA está tomando como nuevo desafío la instalación y demostración de competencia técnica de metodología alternativa al uso de animales para evaluar la sensibilización dérmica generada por distintos estímulos. Este es un parámetro requerido para la aprobación y registro de fitosanitarios y determinados cosméticos, productos de higiene del hogar y dispositivos médicos que tengan contacto estrecho con la piel. Hay en nuestro país varias decenas de empresas que desarrollan y comercializan estos productos y, por lo tanto, con el fin de reducir y reemplazar el uso de animales en estos ensayos, es relevante contar con metodología alternativa para su evaluación, tanto en el curso del desarrollo como al momento de solicitar su registro ante organismos regulatorios.
La sensibilización dérmica, conocida en la clínica como dermatitis de contacto, es la expresión final de un proceso fisiopatogénico que involucra a la reactividad de componentes de la piel en distintos niveles. El reemplazo de animales por metodología alternativa se vale de la integración de ensayos que miden cada uno de los distintos eventos del proceso, un recurso epistemológico y experimental al que se conoce más frecuentemente por su denominación en inglés: adverse outcome pathways (AOP).
Los eventos críticos que se encadenan para dar lugar a la sensibilizacion dérmica son los siguientes (ver Fig. 1): la unión covalente de la molécula en estudio con proteínas de la piel, la respuesta inflamatoria o cambios en la expresión génica a nivel de los queratinocitos, la activación de células dendríticas (del sistema inmune) y, finalmente, la proliferación de linfocitos T que se miden in vivo mediante la prueba de nódulo linfático local (LLNA), que viene siendo el método empleado en la experimentación con animales de este fenómeno. Cada uno de estos eventos clave ha dado lugar al diseño ensayos específicos y la integración de los resultados positivos de tres o más de ellos permite clasificar a la sustancia en estudio como sensibilizante o no sensibilizante.
A través de una tarea compartida por diversos investigadores, en 2012, se consensuó y hoy tiene valor regulatorio, un AOP que permite estimar el riesgo de sensibilización dérmica de una sustancia a través de una secuencia de ensayos in vitro, lo que permite limitar e incluso omitir la exposición de animales de experimentación (Joint Meeting of the Chemicals Commitee and the Working Party of Chemicals, Pesticides and Biotechnology., 2012).
Figura 1: Fases de iniciación de la sensibilización dérmica y sus efectores
(traducido del documento de la OECD ENV/JM/MONO(2012)10/PART1)
Algunos de los eventos críticos han sido operacionalizados con distintas pruebas. En el LMA actualmente estamos instalando la secuencia que incluye una prueba in chemico, el ensayo de reactividad directa de péptidos o DPRA por sus siglas en inglés, la prueba de reactividad de queratinocitos patentada como KeratinoSenseä y la respuesta de un equivalente a las células dendríticas -la línea de células mieloides U937- conocida por el nombre de U-Sensä.
El primer evento clave del proceso de sensibilización es la unión covalente de la sustancia en estudio con proteínas de las células de la dermis. En la prueba DPRA (OCDE 442C, 2020) se promueve una reacción en el tubo de ensayo entre una solución que contiene péptidos ricos en los aminoácidos lisina y cisteína y la sustancia problema. La medición por cromatografía líquida (HPLC) de los niveles de aminoácidos que no formaron la unión covalente, da una medida del riesgo de que, puesta esta sustancia en contacto con la dermis se produzca o no dicha unión covalente dando así inicio al proceso de sensibilización.
La prueba KeratinoSenseä (OECD 442D, 2022) emplea la línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT) genéticamente modificados a los que se le insertó el gen de la luciferasa, una enzima utilizada para medir expresión génica mediante luminiscencia. Cuando aumenta de la actividad antioxidante, aumenta la expresión de genes asociados y aumenta la luminiscencia. Producida esta reacción en la dermis comienzan a sintetizarse y producirse citoquinas proinflamatorias que contribuyen a la génesis de la sensibilización.
Por último, la prueba U-Sensä (OECD 442E, 2023) mide otro evento clave: la expresión de marcadores de membrana, en particular CD86, por células mieloides U-937 que representan la activación de células dendríticas. Una vez activadas, las células migran al nódulo linfático y generan la proliferación de linfocitos T, encargados finales de provocar la respuesta inflamatoria en la piel.
La integración de los resultados de estas tres pruebas permite clasificar a las sustancias en sensibilizantes o no sensibilizantes. Vemos entonces cómo un conocimiento detallado de los procesos fisiopatogénicos que se desencadenan para dar lugar a una dermatitis de contacto, permitió el desarrollo de una batería de pruebas que sirven para reemplazar el uso de animales en la obtención de evidencia tendiente a predecir efectos sensibilizantes sobre la piel.
Bibliografía
Joint Meeting of the Chemicals Commitee and the Working Party of Chemicals, Pesticides and Biotechnology. (2012). The adverse outcome pathway for skin sensitization initiated by covalent binding to protein. Part 1: Scientific Evidence (Issue 168). https://doi.org/ENV/JM/MONO(2007)10
OCDE. (2020). Test Guideline No. 442C In Chemico Skin Sensitisation. In OECD Guidelines for the Testing Chemicals: Vol. Section 4 (Issue 442). https://www.oecd-ilibrary.org/docserver/9789264229709-en.pdf?expires=1615834722&id=id&accname=guest&checksum=8042A61709BFBADE9FC21D47D3A16C1F
OECD/OCDE. (2022). Test Guideline No. 442D: In Vitro Skin Sensitisation. 442D, 1–49. http://www.oecd.org/termsandconditions/.
OECD/OCDE. (2023). Test Guideline No. 442E: In Vitro Skin Sensitisation (Issue 442E). http://www.oecd.org/termsandconditions/.