En la aplicación del principio de las 3Rs suele ponerse el acento en la “R” que se refiere al reemplazo, ya que por motivos humanitarios hay coincidencia en buscar metodologías que eviten el uso de animales de experimentación. En este artículo, primero de lo que será una serie, vamos a compartir algunos insumos teóricos fundamentales para orientar las decisiones en este campo de la investigación.
El campo de los métodos alternativos está en ebullición. Muchos laboratorios, entre ellos el LMA, trabajan en el desarrollo o en el perfeccionamiento de métodos que sustituyan la experimentación con animales. Una pregunta que nos hacemos insistentemente es si estos esfuerzos resultarán en un modelo útil. Y como veremos, la utilidad de un modelo exige alguna reflexión.
Para contextualizar esta pregunta nos permitimos primero una digresión y les pedimos a nuestrxs lectorxs que nos acompañen en ella. Partimos de un ejemplo de la vida cotidiana: ¿podríamos decir que el tren es un medio de transporte útil? La respuesta evidentemente depende de varios factores y podría ser contestada afirmativa o negativamente. Es útil para unir dos puntos distantes decenas, centenares o aún miles de kilómetros pero no lo es si los puntos a unir están separados por un océano o, al contrario, si son dos puntos contiguos como por ejemplo dos barrios colindantes en la misma ciudad. Es más, la utilidad también puede modificarse con el correr del tiempo. El tren era sin duda un medio de transporte mejor a la carreta o al caballo cuando se necesitaba recorrer grandes distancias, pero fue superado luego por el avión para determinados trayectos. Asi, cuando evaluamos la utilidad de un método o de un modelo experimental (uno con animales u otro alternativo) debemos precisar a qué nos referimos y cuál es el contexto en el que responderemos la pregunta. ¿Útil para qué y en qué condiciones? Cuanto más precisa sea la pregunta, más posibilidades tenemos de acercarnos a una respuesta certera.
Como bien señalan Palloca y cols. en un trabajo de reciente aparición y que nos sirvió de inspiración para esta nota (Pallocca and Leist 2022), los tres ejes que definen la utilidad de un método son que sea necesario, que sus ventajas superen a sus desventajas y que sea robusto.
Dejaremos para otra entrega los dos primeros elementos -necesidad y balance entre ventajas y desventajas- y nos centraremos en la robustez. La robustez es una cualidad esencial a la hora de validar un método experimental. No es la única, lo sabemos. También importan su capacidad predictiva y su relevancia, pero hoy tomaremos a la robustez como tema central.
Evaluemos entonces a qué nos referimos con “robustez”. Volvemos para ello a lo revisado por Palloca y cols. (Pallocca and Leist 2022). Un rasgo sine qua non de un método robusto es que sea reproducible, lo que equivale a decir que repetido por distintos investigadores en distintos entornos dé el mismo resultado.
Sin embargo, admitamos que los sistemas biológicos tienen un comportamiento variable y por lo tanto que un determinado procedimiento (input) dé siempre el mismo resultado (output) exige definir cuál es el margen de error o de diferencia que admitimos para decir que dos resultados son iguales. Desde la subdisciplina de los métodos alternativos al uso de animales solemos pensar que la variabilidad que ofrecen los modelos que usan animales de experimentación es superior a la que se logra con métodos in vitro. Esto es así porque aun cuando dos centros empleen la misma especie para llevar a cabo la prueba, difícilmente las condiciones resulten idénticas. Solo a modo de ejemplo: ¿las condiciones de alojamiento son iguales? ¿la cepa es idéntica en un lugar que en otro? ¿el alimento que consumen los animales tiene algún rol en el resultado que se obtiene? ¿el resultado requiere de una evaluación subjetiva por parte de lxs investigadorxs?
La prueba de Draize, considerado por décadas el golden standard para evaluar la irritación ocular producida por distintas sustancias es un ejemplo ya clásico de cómo, la variabilidad entre centros, entre observadores e incluso a lo largo del tiempo, puede afectar de manera significativa la robustez del método. Un análisis sistemático que evaluó más de 9.700 dossiers de ensayos llevados a cabo con la prueba de Draize para clasificar más de 3.000 sustancias demostró algunas inconsistencias entre los resultados obtenidos. Estas inconsistencias no atraviesan de manera transversal a los resultados, ya que los resultados de “no irritante” resultaron reproducibles en un 94%, los de “irritante severo” en un 73%, y se constató un 10% de evaluaciones que resultaron en “no irritantes” después de haber resultado “irritantes severos” en una prueba anterior (Luechtefeld et al. 2017). Es de destacar que una de las fortalezas aducidas de la prueba de Draize (y aun no superadas por los métodos in vitro) es su capacidad para identificar sustancias que producen una irritación reversible. Si la robustez del método para identificar sustancias en las categorías extremas está en discusión ¿cuál será la robustez para las categorías intermedias?
Vistos estos resultados, entre muchos otros que apuntan en el mismo sentido, podríamos señalar que la utilidad de la prueba de Draize, que parecía indiscutida por décadas, puede resultar debilitada cuando su robustez entra en cuestión. El detalle, volviendo al principio, es conocer con la mayor precisión posible, en qué entornos y para qué tipo de sustancias, por ejemplo, la prueba de Draize es robusto y para cuáles no lo es en la misma medida.
Un trabajo publicado por nuestro laboratorio (Rivero et al. 2021) propone un algoritmo para definir la robustez de distintas variantes del método HET-CAM para evaluar irritación ocular[1]. Aplicando el método a productos cosméticos, y tomando como criterios orientadores el tiempo que el producto estaría en contacto con el ojo y el tipo de surfactantes contenidos en la mezcla, sugiere para qué tipo de productos y en qué condiciones sería razonable elegir una u otra variante del método evaluado. Así, con trabajos como el nuestro se van delineando alcances y limitaciones de los distintos métodos de que disponemos y por lo tanto vamos respondiendo acerca de qué tan útiles pueden ser reconociendo y delimitando el contexto de aplicación.
Compartimos estas reflexiones con quienes nos leen habitualmente ya que el debate acerca de la utilidad, relevancia y pertinencia de reemplazar los animales de experimentación por otras metodologías está aún lejos de zanjarse, y debemos por lo tanto ir acopiando insumos teóricos para que las decisiones que vamos tomando sean en el mayor beneficio de los usuarios de los productos que evaluamos.
Esta serie…. continuará.
Invitamos a lxs lectorxs a ampliar estos conceptos en la siguiente bibliografía, en la que nos inspiramos para la preparación de este artículo.
Luechtefeld, Thomas et al. 2017. “Mining Publicly Available 2008 – 2014 REACH Data.” 33(2): 123–34.
Pallocca, Giorgia, and Marcel Leist. 2022. “On the Usefulness of Animals as a Model System (Part II): Considering Benefits within Distinct Use Domains.” Altex 39(3): 531–39.
Rivero, Martín Nicolás et al. 2021. “Comparison between HET-CAM Protocols and a Product Use Clinical Study for Eye Irritation Evaluation of Personal Care Products Including Cosmetics According to Their Surfactant Composition.” Food and Chemical Toxicology 153: 112229.
[1] La prueba HET-CAM emplea como matriz biológica la membrana corioalantoidea del huevo embrionado de gallina para evaluar la potencialidad de una sustancia para producir irritación ocular.